La monensina inhibe las contracciones de las vías respiratorias mediadas por mastocitos en modelos de asma en humanos y cobayos

Sensibilización y preparación de tejidos de cobayos

Las cobayas Dunkin-Hartley (Invigo, Horst, Países Bajos) se alojaron en las instalaciones para animales (KM-F (Laboratorio Astrid Fagros), Karolinska Institutet, Solna, Suecia) con libre acceso a alimentos y agua. Los animales, que pesaban entre 350 y 400 g, se sensibilizaron a HDM a través de una sola cavidad intraperitoneal (IPSe inyectó extracto de HDM (número de kit 369446, Greer Laboratories, Lenoir, NC, EE. UU.) con adyuvante (100 μg/100 mg de proteína HDM/hidróxido de aluminio). Después de dos semanas de sensibilización, los conejillos de Indias fueron asesinados con dióxido de carbono.2, para aislar cuidadosamente la tráquea que se cortó en anillos intactos en tampón Krebs-Henseleite frío. Los cortes traqueales se cultivaron en 1 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, Auckland, Nueva Zelanda) con penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml; Gibco) en una incubadora humidificada a 37 °C con carbógeno (95 ) . % s2 y 5% CO2) durante la noche en condiciones estériles. Se añadió monensina (1 o 10 μM) o vehículo (etanol al 1%) al día siguiente y se incubó durante otras 24 ho 72 h con cambio diario de medio y adición de nuevos compuestos. Después del cultivo, los portaobjetos se montaron en baños de tejidos (EMKA, París, Francia) para estudios funcionales.

Aislamiento y cultivo de vías respiratorias humanas.

Con la aprobación del Comité de Ética de Estocolmo (2018/1819-31/1) y el consentimiento de los pacientes que se sometieron a lobectomía, se recolectó tejido pulmonar humano sano y se diseccionó en un congelador Krebs. Se aislaron vías respiratorias de entre 0,5 y 2 mm de diámetro, se cortaron en secciones y se cultivaron en 0,5 ml de medio de cultivo durante la noche antes de montarlas en un sistema de miografía (Modelo 700MO; DMTA/S, Aarhus, Dinamarca) en el que se evaluaron las contracciones del músculo liso después de 24 horas. de cultivo Con o sin monensina (1 o 10 µM) está presente.

Órganos de tejido de baño y miografía

En los días experimentales, se montaron anillos traqueales de cobayo o secciones traqueales humanas en cámaras de baño/baño intramuscular de 5 mL con solución de Krebs, que se mantuvieron a 37 °C y se hirvieron con carbógeno (5% CO).2 al 95% O2) para mantener el pH en 7,4. La fuerza del músculo liso se registró, amplificó y mostró en el software LabChart (versión 7.3.8, ADInstruments, NSW, Australia). Una hora antes de las pruebas farmacológicas, se aplicó un aumento gradual de la tensión a 30 mN (para cobayas) o 1,5 mN (para bronquios humanos) por etapas con tres lavados intermedios.

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Para investigar el efecto directo de la monensina, se añadió monensina 1 o 10 μM en baños/cámaras con cortes traqueales de cobayo y bronquios humanos durante 2 h con o sin pretratamiento con H-histamina.1 Antagonista de los receptores (mepramina, 1 μM, tratada durante 30 minutos). Las contracciones se normalizaron a respuestas máximas inducidas por histamina (10 nM-1 mM, en la tráquea de un cobayo) y cloruro de potasio (KCl, 60 mM, en los bronquios humanos).

Para estudiar el efecto de la monensina en la viabilidad del tejido y en las respuestas de histamina, las secciones después del cultivo durante 24-72 h (tráquea de cobayo) y 24 h (bronquios humanos) se expusieron a carbacol (1 nM a 0,1 mM) e histamina (10 nM). -1 mM). Se hizo referencia a las contracciones máximas como la contracción a la concentración más alta de carbacol. Para determinar la viabilidad del tejido, se midió el efecto en fuerza absoluta (mN).

Modelo in vivo de conejillo de Indias

Después de 2 semanas de sensibilización con HDM (100 mcg/100 mg de proteína HDM/hidróxido de aluminio, IP), cobayos despiertos fueron desafiados por vía intranasal con 25 μg de HDM en 100 μl de PBS, una vez por semana durante tres o cinco semanas consecutivas. Los animales de control recibieron 100 mg de hidróxido de aluminio para la sensibilización (IP) y 100 µl de PBS para cada desafío (en). Veinticuatro horas antes de cada desafío, los animales recibieron 0,5 mg/mL de monensina en 200 μl de etanol al 12,5 %/PBS. Se administró vehículo (etanol al 12,5 %/PBS) o monensina a los animales de control. Los pesos de los animales se documentaron antes de cada desafío. Un día después del último desafío, los animales fueron anestesiados IP Inyección de clorhidrato de ketamina 40 mg/kg (Ketaminol® Vet., Intervet, Estocolmo, Suecia) y clorhidrato de medetomidina 0,5 mg/kg (Cepetor®Vet., VETMEDIC, Estocolmo, Suecia). Se inyectaron anestésicos adicionales cuando fue necesario. Animales secados y ventilados con el sistema FlexiVent.18 (flexiVent FX4, SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canadá), en el que se evaluaron las respuestas de las vías respiratorias a la metacolina (0,03125 mg/ml a 0,25 mg/ml). Ajustes del nebulizador: Velocidad de salida del aerosol: 0,40 ml/min, Velocidad de suministro: 54,6 %, Ciclo de trabajo del nebulizador: 50 %, Tiempo de pulverización: 10 segundos. Se usaron animales ingenuos como controles. Después de estudiar la respuesta de las vías respiratorias, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de ketamina y medetomidina seguida de excreción de sangre a través de una punción cardíaca.

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Histología

Después de los experimentos farmacológicos, se fijaron cortes de tráquea de cobayo en solución de Carnoyi (60 % de etanol, 30 % de cloroformo y 10 % de ácido acético) para análisis histológicos. Después de los experimentos in vivo, los lóbulos pulmonares caudales derecho e izquierdo se recolectaron y fijaron en solución de Carnoy (para tinción con azul de Astra) y formalina tamponada neutra al 10% (para tinción con hematoxilina-eosina) para procesos histológicos adicionales. El tejido se secó, se incrustó en parafina y se cortó en rodajas de 5 μm para la tinción. Para identificar los MC, se tiñeron cortes de tráquea de conejillo de indias y secciones de pulmón caudal derecho con azul Astra para detectar heparina en gránulos de MC.20. Se registró la intensidad de la tinción (1: pálido, 2: medio, 3: fuerte). Se usó la tinción con azul de Astra-hematoxilina para evaluar los núcleos de MC para determinar la muerte de los MC. El análisis de la inflamación de las vías respiratorias se realizó en portaobjetos teñidos con hematoxilina-eosina (Histolab, Göteborg, Suecia). Las imágenes de los portaobjetos teñidos se tomaron con un escáner de portaobjetos Zeiss AxioScan.Z1 (ZEISS, Ostfildern, Alemania) con un aumento de × 20. Se analizaron los bucles traqueales o todas las vías respiratorias intactas presentes en los portaobjetos teñidos. Los mastocitos se contaron manualmente. El área inflamatoria infiltrante y el diámetro bronquial se calcularon utilizando el software ZEN (versión 3.3, versión azul, ZEISS, Ostfildern, Alemania). Todas las cantidades se hicieron ciegas y se normalizaron con el diámetro bronquial.

quimicos y proveedores

El tampón de Krebs-henselita, penicilina, histamina, indometacina, acetilcolina, cloruro de potasio, cloroformo, ácido acético, mepiramina, monensina, mAb IgE antihumano (número de producto: I6510) y Astra blue se adquirieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO , EE.UU).

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Cálculos y Estadísticas

Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Para la evaluación estadística, se realizó ANOVA de una o dos vías seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey utilizando GraphPad Prism (versión 8.0.1 (244), San Diego, CA, EE. UU.). s< 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Consentimiento ético y consentimiento para compartir

Todos los experimentos relacionados con cobayos y bronquios humanos fueron aprobados por el Comité de Ética de Estocolmo (número de permiso: 10973-2019 y 2018/1819-31/1). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado para la participación de los pacientes. El estudio se informó de acuerdo con las pautas ARRIVE.

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